吸血した蚊の血液から吸血後経過時間の推定を目的としたヒトDNA型判定の試み 研究活動 | 研究／産学官連携

古屋大学大学院医学系研究科 研究科長 門松 健治 法医･生命倫理学研究室

廣重 優二 ゆう 研究生 山本 敏充 や ち 准教授

石井 い い あ 教授 研究 ループ 埼玉医大 岐阜大学 大阪医科大

学及 大日本除蟲菊株式会社中央研究所 共 吸血 た蚊 DNA 分析

個人識 及 吸血後 経過 間推定 程度可能 い 明 た

犯罪現場 特 夏場 屋内 犯罪現場 見 吸血 た蚊 特

生 た蚊 血液 犯人や犯罪 関係 た人 血液 含 い 可能性 非常 高

い いえ 研究 ループ 吸血 た蚊 DNA を抽出 犯人や犯罪

関係 た人を特定 可能 た 個人識 可能 経過 間 程度

さ ヒト由来 ^DNA 定量値 吸血 た後 経過 間を推定 可能

を調 を目的 日本 頻繁 観察さ ヒト マカ及 アカイエカを用

い 実験を行い た

そ 結果 個人識 を た STR 型 定 吸血後２日経過 可能 あ

た 得 た定量値 定量値比 型 定数 ピー 高比 総合的 断 吸血

後 半日単 経過 間推定 可能 あ 示唆さ た 本研究 大日本

除蟲菊株式 会社中 央研 究所 専 用飼育 箱 飼育さ 感 染歴 い 蚊 提供を 受

被験者 安全を確保 実験を行う 可能 た た 吸血

後 間経 過を比 較的 コントロー ル や い 系統的 実験方 法を 新た 考案

た

今後 例数を増や た 血液消化 比較的緩や 進 比較

的 分子化 進行 遅い DNA 定量方法を使用 さ 精度 高い吸血

後経過 間推定 可能 期待さ 本研究 得 た結果 犯罪現場

蚊 刺さ い い い た DNA 鑑定 畏怖感を感 させ いう点

犯罪抑止 社会貢献度 非常 高い 考え

本研究成果 米国科学誌 あ PLOS ONE 米国東部 間 2017 6 月 15 日付 電

子版 掲載さ た

吸血 蚊 血液 吸血後経過時間 推定 目的

DNA ^{型 定 試}

吸血 蚊 血液 吸血後経過時間 推定 目的

DNA ^{型 定 試}

ン

○現在 個人識 世界 汎用さ い _STR 型 定用 ッ 使用

○蚊 血液消化 伴う _DNA 分解 程 利用

○被験者 侵襲 少 吸血後 経過時間 コン 系統的 実験手法

○半日単 いう 経過時間 あ 吸血後経過時間推定 可能

．背景

吸血蚊 由来 _DNA型 定 い 国 自身 蚊 吸血さ 型 定

行 例的研究 発表さ 国際的 蚊 _DNA型 定 症例報告 学会発表

行わ い 系統的 研究 未 い 最大 原因 感染歴

い蚊 統一的 吸血さ 手法 う 状況 本研究 い

殺虫剤 開発 比較的無菌的 蚊 育 い 大日本除蟲菊 株 中央研究所 共

系統的 実験 行う 可能

一方 血液 個人特定 い 多色 蛍 標識 用い 多 _{STR short}

tandem repeat ^{時増幅 一 型 定 チ ッ 法 数種 ッ 化さ 個人}

識 汎用さ い 分子化 _DNA試料 対応 ッ 市販さ い

ッ 使用 対照 試料や タ あ 一卵性 生児 除

100^{％ 確率 個人 特定 可能 い う チ}

ッ 法 鋳型_DNA 分子化 程 型 定さ 数 異 型 定さ

数 あ 程 経時変化 推察 可能

さ 近 増幅産物 大 さ 異 種類 対 一 定量的 _PCR 行い

各 定量値 比 抽出_DNA 質 分子化 程 数量化 調べ 方法 利用さ

う

本研究 学術的背景 元 吸血後 蚊 部 人血 消化状態

DNA ^{分子化状態 違い 利用 吸血後経過時間 あ 程 推定 行う 時 個}

人識 可能性 い 検討

う 経過時間 推定や個人識 手法的 確立さ 犯罪現場 犯人や犯罪 関係

人 特定 犯行時間 推定 一 材料 重要性 高 犯罪抑止 いう点 社会

的 貢献 非常 高い 考え

．研究成果

( ) ^{吸血蚊 採 及び顕微鏡的検査}

被検者計 い 卵 専用 育箱 育さ 蚊 エ ：Culex pipiens pallens

及び ：Aedes albopictus ^{一匹 透明 直径約} cm ^高さ約 cm ^形

チッ ッ 入 開放部 薄手 ン ッ ン 覆い ン 部分 各被験者

腕 当 蚊 ン 通 十分吸血 段階 腕 ッ 離

ン 部 ッ 置 ョ糖溶液 湿 ぶ 設定さ 経過時間

12 18 24 36 48 72^{時間 後 ッ エチ エ}

和 袋 入 殺虫

後 直 実体顕微鏡写真 撮影 後述 _DNA抽出 ッ _ATL緩衝液 入 _{1.5 mL}

チュ 入 各チュ ッ 入 凍結 _DNA抽出 ₃₀℃

保

各経過時間 殺虫直後 実体顕微鏡像 代表例 図

種 蚊 時間経過 共 腹部 吸わ 血液 次第 腹部 端 徐々 卵

巣 白い部分 成熟 い ₇₂時間経過 全 血液 消化さ 腹部 卵巣

占 い わ

図 ．各吸血後経過時間 実体顕微鏡像例

段 エ 段 倍率約₂₀倍

(a)^無吸血 (b) ^{時間 吸血終了直後} (c)^吸血後24^時間経過 (d)^吸血後72^時間経過

( ) DNA^定量

各吸血蚊 QIAamp DNA Micro ^{ッ 付属} ATL^{緩衝液 ッ チッ 破} 壊 後 ッ コ 従 _DNA抽出 行い 溶出液 _{20 μL low TE}緩衝

液 回行い

吸血後 各経過時間 各増幅産物 濃 _{Q41 Q129}及び_{Q305 pg/μL} 均 対数値

図 エ 吸血直後 _{Q41 Q129}及び_Q305 3.24 (1,750

pg/μL) 3.14 (1,370 pg/μL)^及び3.09 (1,230 pg/_μL) ^{次第 減少} 72^{時間後 検出さ}

次回帰曲線 図 う 得 決定係数 _R

2 _0.92

0.93 ^及び0.89 ^{一方 吸血直後} Q41 Q129^及びQ305

3.03 (1,070 pg/μL) 3.05 (1,110 pg/μL)^及び3.03 (1,070 pg/_μL) ^{エ 様 次第}

減少 ₇₂ 時間後 検出さ 次回帰曲線 図 う

得 決定係数 _R

2

い _0.97 高 強い相関 見

図 ．吸血後 各経過時間 各増幅産物 a:41 bp b:129 bp c:305 bp ^定量値 pg/_μL

均 対数値 段 エ 段

定量値 図 う 各定量値比 Q129/Q41 Q305/Q41 Q305/Q129 ^算出さ

次回帰曲線 得 エ 定量値比_{Q129/Q41 48}時間 約_1.0

一定 あ 対 定量値比 _Q305/Q41及び_Q305/Q129 約_0.7 一方

エ 様₄₈時間 約_1.0 一定 あ 対 定量値比_Q305/Q41及 び_{Q305/Q129 36}時間経過 い _{1.0 0.7}及び_{1.0 0.8} 次第 減少

各定量値比 ₄₈ 時間経過後 い 約 _0.4 各定量値比 _Q129/Q41 Q305/Q41^及びQ305/Q129 ^{得 次回帰曲線 決定係数} R^{2 エ} 0.88 0.69

及び_{0.77 0.84 0.92}及び _0.96 強い相関 見

吸血直後 時間経過 エ 変動 大 比較

的安定 定量値 得

図 ．吸血後 各経過時間 各増幅産物 定量値比 a:Q129/Q41 b:Q305/Q41 c:Q305/Q129

均 対数値． 段 エ 段

( ) STR^{型 定}

現在 日本 犯罪捜査 主 用い い Amた位ℓ８T７

ぼ Identifiler^ぼ Plus PCR Amplification

a) b) c)

a) b) c)

Kit ^{ノ 社 用い 各}DNA^抽出液1 _μL ^{鋳型 コ 従} PCR ^{増 幅} Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer ^{電 気 泳 動 後} GeneMapperID ^{ウエ 自動的 型 定 行い 閾値} 50 RFU ^{蛍 強}

用い

各吸血後 経過時間 均 図 _(a) う 数 検出さ 回帰曲線

得 均 高 対数値 図 _(b) 及び _X 各

均相対 高 算出さ い 次回帰曲線 得 一般的

特 均 高 強い相関 得

図 ．吸血後 各経過時間 _STR型 均 検出数_(a) 均 高_(b) 対数値

均相対 高_(c)． 段 エ 段

( )

以 結果 個人識 _STR 型 定 吸血後 日経過 可能 あ

得 定量値 定量値比 型 定数 高比 総合的 断 吸血後 半日単

経過時間推定 可能 あ 示唆さ

．今後 展開

現在 蚊 男女一人 吸血 場合 考え _Y染色体 _STR型 い 様 実験

重 い 今後 例数 増や 精 共 あ 分子化 進 い い状態

DNA ^{分解 程 わ 定量方法 考案 数時間単 吸血後 時間}

経過 推定 方法 確立 努 い 考え い

．用語説明

STR^型：short tandem repeat^型

短鎖 復配列型 いい ～数塩基 例え _AGCT 一 復単 個

人 異 復数 型 個人識 行う 日本 ₁₅個 _STR

型 時 増幅 型 定 市販 ッ 用い 型 定 さ 指紋

タ 様 犯罪者用 タ 構築さ い

a) b) c)

増幅産物：_PCR Polymerase Chain Reaction DNA ^{あ 特定領域 増幅}

本実験 定量的_PCR法 _DNA あ 部分 異 長さ ₄₁塩基 ₁₂₉

塩基 ₃₀₅塩基 _PCR増幅 分子化 _DNA 長さ 短

い 多 増幅 や い 利用 抽出_DNA 分子化 程 推定

う

数：両親 一 継 型 数

通常 _DNA 両親 継い 場合 接

合体 例え _STR型_14-14 型 呼び 数 あ 異 継い 場合 接合体 例え _STR型_12-13 型 呼び 数

あ 本実験 接合体 場合 あ 考え 場合

数 本 ッ ₁₆ 含 接

合体 関わ 全 型 定さ 場合 検出さ 数 ₃₂

回帰曲線：_S 型 回帰 曲線

通常 あ 地点 極端 増加 減少 変化 示 曲線 本実験

あ 時点 極端 数 検出さ 曲線 回帰さ い

．発表雑誌

Yuuji Hiroshige¹, Masaaki Hara², Atsushi Nagai³, Tomoyuki Hikitsuchi⁴, Mitsuo Umeda⁴, Yumi Kawajiri⁴, Koji Nakayama⁴, Koichi Suzuki⁵, Aya Takada², Akira Ishii¹, Toshimichi Yamamoto¹

1 Department of Legal Medicine and Bioethics, Graduate School of Medicine, Nagoya University

2 Department of Forensic Medicine, Saitama Medical University

3 Department of Legal Medicine, Graduate School of Medicine, Gifu University

4 Research & Development Laboratory, Dainihon Jochugiku Co., Ltd.,

5 Department of Legal Medicine, Osaka Medical College

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PLOS ONE

DOI: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0179319

English ver.

https://www.med.nagoya-u.ac.jp/medical_E/research/pdf/PLOSONE_20170616en.pdf